Cпиртовые дрожжи
СОДЕРЖАНИЕ
Введение...........................................................................................
Глава 1. Характеристика спиртовых дрожжей..............................................
1.1. Краткая история использования дрожжей.......................................
1.2. Сравнительные характеристики различных промышленных рас
спиртовых дрожжей..................................................................
Глава 2. Производственное использование дрожжей.....................................
2.1. Технология применения дрожжей.................................................
2.2. Описание технологического процесса приготовления
производственных дрожжей.......................................................
2.2.1. Разведение дрожжей из чистой культуры................................
2.2.2. Приготовление производственных засевных дрожжей................
2.2.3. Получение маточных дрожжей............................................
2.2.4. Сбраживанне производственного сусла.................................
Заключение........................................................................................
Литература....................................................................................
ВВЕДЕНИЕ
В связи со сложившейся большой конкуренцией на рынке алкогольной продукции получение высококачественного спирта является одной из наиваж
нейших задач. Известно, что существенное влияние на формирование вкуса и аромата спирта оказывают летучие примеси, образующиеся в процессе брожения и не удаленные при ректификации . Основными факторами, оказывающими негативное воздействие на органолептические показатели пищевого спирта, являются плохое качество зернового сырья и воды, высокие температурные режимы при водно-тепловой обработке зерна, экстремальные для дрожжей технологические параметры брожения (повышенная температура и концентрация сухих веществ сусла, увеличенные сроки брожения), недостаточное соблюдение микробиологической чистоты процесса. При этом наиболее существенное влияние оказывает качество перерабатываемого сырья. Сорность зерна, содержание токсичных примесей, зараженность вредителями хлебных злаков, излишняя влажность, инфицирование зерна фитопатогенной микрофлорой и эпифитными микроорганизмами (плесневыми грибами, дикими дрожжами и бактериями) все это приводит к повышению образования побочных метаболитов, придающих спирту излишнюю горечь, жесткость и резкость, не характерный спирту запах.
Кроме того, как на образование летучих примесей, их количество и состав, оказывает также влияние раса используемых дрожжей. Поэтому проведение исследований по применению спиртовых дрожжей нового поколения даст возможность не только интенсифицировать процесс брожения, но и повысить качество спирта.
Актуальность темы работы обусловлена тем, что производственная база спиртовой отрасли насчитывает несколько сотен заводов, как больших, так и мелких, обладающих достаточным потенциалом для полного удовлетворения потребностей в пищевом спирте высокого качества. На действующем оборудовании спиртзаводов объем стабильного производства спирта можно довести до 200 млн. дал и более в год без введения в действие дополнительных мощностей. Однако, за последние годы вследствие обострения проблем выпуска алкогольной продукции, низкой рентабельности производства значительно понизился уровень технической оснащенности предприятий. Износ основного технологического оборудования большинства спиртзаводов достиг 50% .
Поэтому необходимо дальнейшее совершенствование технологических процессов, создание новых ресурсосберегающих технологий и оборудования с целью интенсификации спиртового брожения, снижения себестоимости получаемой продукции, сокращения расхода теплоэнергетических ресурсов, максимального использования существующих мощностей спиртового производства, повышения качества и конкурентоспособности продукции на отечественном и мировом рынке .
Узким местом на спиртовых заводах остается бродильное отделение. Увеличение производительности бродильного отделения путем установки дополнительных бродильных емкостей требует больших капитальных затрат. Повысить эффективность работы бродильного отделения можно как за счет расширения ассортимента используемых ферментов, так и за счет улучшения качества спиртовых дрожжей. Традиционно, до недавнего времени в спиртовой промышленности применяли одну расу дрожжей, обеспечивающую достаточную скорость брожения и устойчивый выход спирта. В последние годы разработаны новые виды рас дрожжей.
Цель работы: провести сравнительную характеристику различных промышленных рас спиртовых дрожжей и изучить, как дрожжи используются в производстве.
Анализ литературы о современном состоянии производства в спиртовой отрасли, проведенный с учетом результатов экспериментальных исследований, достижений зарубежной и отечественной науки и практики позволяет определить основные задачи для создания интенсивной технологии получения спирта на основе комплексного использования мультиэнзимных систем целевого назначения и новых рас спиртовых дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами. Для их реализации необходимо провести, что является задачами данной работы, анализ промышленных и новых отселекционированных рас спиртовых дрожжей; исследовать уровень бродильной активности отобранных рас дрожжей; показать как производится скрининг дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами; изучить влияние температуры, концентрации сухих веществ зернового сусла и спирта на жизнедеятельность дрожжей.
ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ 1.1. Краткая история использования дрожжей
Дрожжи относятся к одним из самых старейших микроорганизмов, культивируемых человеком. Много веков назад дрожжи уже применялись при получении пива, вина. Однако впервые дрожжевые клетки увидели в 17 веке, когда Левенгуком был сконструирован микроскоп. Последующие полтора столетия заметного прогресса в исследовании дрожжевых клеток не отмечалось. Только в 19 веке классические исследования Л. Пастера позволили рассматривать процесс спиртового брожения как физиологический процесс, связанный с жизнедеятельностью дрожжевой клетки. Впоследствии были проведены глубокие исследования по обоснованию схемы биохимизма спиртового брожения. Дрожжи сыграли историческую роль в развитии биологических наук, им принадлежит также особая роль в открытии и расшифровке процессов анаэробного и аэробного окисления Сахаров, лежащих в основе существования живого мира.
Особый интерес представляют дрожжи рода Saccharomyces, которые объединяют наибольшее число дрожжей, имеющих промышленное применение в различных отраслях бродильных производств. В результате длительного культивирования в производственных условиях эти дрожжи приобрели характерные признаки, по которым они и отличаются от так называемых «диких» дрожжей.
Для сбраживания крахмалсодержащего сырья в спиртовом производстве до сих пор широко применяют дрожжи S. cerevisiae p.Xl 1, а также расы М -смесь нескольких рас, выделенные в Германии в 1902-1905 г.г. Таким образом, почти 100 лет основная раса спиртовых дрожжей оставалась неизменной.
Фундаментальные исследования по физиологии спиртовых дрожжей, азотистому и фосфорному обмену веществ были проведены проф. Коноваловым С.А. Было подтверждено, что содержание азота в сбраживаемых субстратах в значительной степени определяет скорость синтеза и образование биомассы дрожжей. Показано, что наиболее легко ассимилируемым является азот аминокислот. Азот амидной формы в присутствии аминного азота практически не потребляется. При аэрации потребление амидной формы возрастает.
Наиболее пригодными для дрожжей, с точки зрения расхода энергетических затрат, является азот аминокислот. Процесс использования дрожжами аминокислот в качестве источника азота изучался еще Эрлихом, который показал, что аминокислоты дезаминируются гидролитическим путем, а освободившийся аммиак ассимилируется дрожжами. Но работы, проведенные Торном, Уайтом, Коноваловым, в корне изменили эти взгляды. Была выдвинута теория прямого усвоения аминокислот и доказано, что лучшим источником азота для дрожжей является смесь аминокислот. Проведенные в институте исследования показали, что наиболее интенсивно процесс роста, развития и размножения дрожжевых клеток протекал на средах, содержащих полную смесь аминокислот, а не индивидуальную аминокислоту, использование которой осуществлялось через переаминирование. В результате была показана возможность прямой ассимиляции аминокислот, что позволяет клетке использовать для питания не только азот, но и углерод, а также экономить энергию, расходуемую на синтез аминокислоты. Обогащение питательной среды свободными аминокислотами в результате протеолиза белков зерна протеолитическими ферментами способствует сокращению расхода сахара на построение биомассы дрожжей и образование побочных продуктов, что приводит в конечном итоге к увеличению выхода спирта.
Создание современных прогрессивных технологий для интенсификации процесса брожения диктует необходимость выделения новых более физиологически активных рас дрожжей, а также разработку различных приемов и способов, позволяющих повысить эффективность дрожжевых клеток при сбраживании крахмалсодержащего сырья. Однако в отечественной промышленности недостаточное внимание уделялось созданию новых рас дрожжей.
В последние 10 лет в промышленности были испытаны и внедрены такие новые расы дрожжей, как:
Г-660, гибридная раса, выделенная в Институте генетики РАН путем половой гибридизации S. cerevisiae и S, pombe, обладающая повышенной декстринолитической активностью;
ВПУ-408, полученная во ВНИИПБТ методом автоселекции при росте дрожжей р.Х11в условиях повышенных температур;
термотолерантные расы К-81 (полученные КТИПП и ВНИИПБТ) и XII Т (УкрНИИспиртбиопрод);
гибридные расы дрожжей Y-717, 985, полученные во ВНИИПБТ.
Эти расы спиртовых дрожжей обладали термотолерантными свойствами, но не отличались достаточной устойчивостью к полученным признакам, особенно при длительном культивировании их в производственных условиях. Кроме того, при хранении дрожжей установлено, что некоторые из них склонны к реверсии, диссоциируют и при рассевах дают колонии, обладающие различными физиологическими свойствами.
Физиологическая активность дрожжевых клеток, используемых при получении этанола, является одним из важных факторов, определяющих эффективность спиртового производства. Бродильная активность и продуктивность дрожжей, плотность дрожжевой популяции оказывают существенное влияние на стабильное протекание процесса брожения, скорость сбраживания крахмалсодержащего сырья и выход целевого продукта.
Однако в процессе жизнедеятельности дрожжей возникают не зависящие от микроорганизмов факторы, негативно влияющие на физиологическое состояние дрожжевых клеток. К таким факторам можно отнести повышение температуры в процессе дрожжегенерации и спиртового брожения (особенно в летний период времени), которое негативно сказывается на развитии дрожжевых клеток и их жизнедеятельности, что приводит к замедлению брожения, неполному сбраживанию и снижению техноэкономических показателей производства. Кроме того, в результате создаваемых извне или возникающих в процессе жизнедеятельности дрожжей условии субстратного лимитирования, ингибирования продуктами метаболизма и другими физико-химическими показателями среды (температура, рН, кислотность и др.) происходят необратимые процессы, негативно сказывающиеся на качестве дрожжевых клеток. Продолжительная генерация промышленных рас дрожжей также ведет к ослаблению культур и утрате их технологических возможностей.
Во ВНИИПБТ осуществлены работы по выделению новых, более физиологически активных рас спиртовых дрожжей. Одним из путей, позволяющих повысить эффективность дрожжевых клеток при сбраживании крахмалсодержащего сырья является проведение работ по селекции и отбору физиологически активных клонов спиртовых дрожжей, технологически устойчивых к неблагоприятным факторам, обладающих повышенной продуктивностью, осмофильностью и термотолерантностью. Получение таких активных рас спиртовых дрожжей даст возможность повысить эффективность спиртового производства в результате интенсификации процессов дрожжегенерации и брожения, сокращения потерь спирта и сырья.
В связи с вышеизложенным, на первом этапе работы мы проведем сравнительные исследования различных промышленных рас спиртовых дрожжей, выделенных из производственных культур спиртовых заводов и полученных из музеев ВНИИПБТ, ВНИИ генетнки, УкрНИИспиртбиопрод, по бродильной активности, продуктивности и термотолерантности. 1.2. Сравнительные характеристики различных промышленных рас
спиртовых дрожжейПроведенный анализ литературы по используемым расам дрожжей на заводах отрасли показал, что основными промышленными культурами являются Saccharomyces cerevisiae расы: ХП, Y-717, К-81, 660, 86, 985. Следует отметить, что основная масса колоний промышленных рас дрожжей отличалась по культуральным и морфологическим свойствам. Наибольшей бродильной активностью в стандартных условиях на солодовом сусле (30°С, 16-17% СВ) обладали дрожжи расы ХП и K-8'l, а продуктивностью - ХП, К-81, 985 и Y-717. Более устойчивыми к повышенным температурам проявили себя дрожжи S. cerevisiae Y-717, 985, К-81 и ХП-Т.
Селекционные работы по скринингу физиологически активных вариантов проводились из промышленных культур, гибридных штаммов и лабораторных популяций, подвергнутых длительным генерациям при повышенных температурах или концентрациях среды. При проведении селекционных работ основным признаком служила осмофильность и исследуемых штаммов дрожжей их термотолерантность. На первом этапе исследований проводили сравнение спиртовых дрожжей рас ХП, К-81, Г-660, Y-717 и 985 при культивировании их на средах с концентрацией сухих веществ 22-24%. Лучшие результаты получены при использовании дрожжей рас ХП и 985.
Отбор дрожжей проводили по бродильной активности и продуктивности клеток на 10 и 24 часа брожения в период их максимальной физиологической активности. Наибольшей продуктивностью обладали дрожжи расы 985, которые были использованы в качестве родительского штамма для дальнейших селекционных работ.
Динамика сбраживания сусла отобранными расами дрожжей приведена на рис. 1. Как видно из рисунка, лучшие результаты получены при использовании дрожжей рас ХП и 985. Концентрация несброженных углеводов (РВ) к 72 часам брожения составила 0,59 и 0,52%, а этанола - 10,8 и 11 ,2 % об., соответственно.
Один из способов повышения рентабельности спиртового производства является использование высококонцентрированного зернового сусла. Важным условием эффективного сбраживания сусла повышенной концентрации должно быть применение дрожжей, обладающих высокой осмофильностью.
Известно, что повышение концентрации сбраживаемого сусла и возрастание содержания спирта приводит к затормаживанию процессов дрожжегенерации и брожения. Увеличение концентрации синтезируемого спирта угасающе действует на рост, размножение и бродильную активность дрожжевых клеток. Рисунок 1.
Динамика потребления общих углеводов и накопления спирта
различными расами дрожжей на высококонцентрированном
пшеничном сусле
Уже при концентрации спирта более 5% об. наблюдается ингибирование процесса почкования клеток; при концентрации этанола выше 12% об. - полное подавление роста дрожжей .
Снижение физиологической активности дрожжей зависит как от концентрации спирта, так и от состава среды. Рост дрожжей в сусле повышенных концентраций лимитируется недостатком азотистого питания. При увеличении концентрации сусла повышается степень влияния азотистого питания на размножение дрожжевых клеток и процесс брожения. Использование зернового сусла, обогащенного аминньш азотом в результате протеолиза растительных белков сырья, способствует повышению бродильной активности дрожжей, их осмофильности и толерантности к спирту. Применение комплекса протеиназ и пептидаз для обработки сусла с концентрацией сухих веществ 24% позволило сбраживать среды дрожжами S.cerevisiae p.Xll с нормативными технологическими показателями брожения за 72 часа. Дальнейшее повышение концентрации сусла приводило к замедлению процессов дрожжегенерации и брожения .
Таким образом, получение дрожжей, толерантных к основному продукту их жизнедеятельности, является одной из возможностей интенсифицировать биохимические процессы спиртового брожения.
Селекцию и скрининг дрожжей, обладающих осмофилъными свойствами, проводили по способности отобранной расы сбраживать высококонцентрированное сусло. Адаптацию родительской расы к повышенному осмосу осуществляли путем многократного пассажирования клеток на жидких питательных средах с возрастающей концентрацией сухих веществ (24-32%).
В результате из большого числа выделенных вариантов культур путем поэтапного отбора были отселекпионированы популяции дрожжей, наиболее устойчивые к супраоптимальному осмосу и температуре, и получена активная термотолерантная и осмофильная раса дрожжей 985Т и ее варианты, а также осмофильная раса 987О.
Для поддержания их в активном состоянии были подобраны питательные среды, обеспечивающие сохранение приобретенных свойств культур в течение длительного времени.
В дальнейшем можно определить устойчивость отселекционированной расы 985 Т к повышенным концентрациям спирта. Для этого дрожжи культивировали на ячменном сусле с концентрацией сухих веществ 18,6% с внесением в среду на 24 часа культивирования различные количества этанола (от 3 до 7 % об.). Контроль за процессом осуществляли по росту, размножению и состоянию дрожжей, потреблению углеводов и образованию спирта (табл. 1).
Через 24 часа брожения количество несброженных углеводов составило 3,2 %, а концентрация спирта - 6,5 % об. При изучении влияния различных концентраций спирта на жизнедеятельность отселекционированного штамма было установлено, что при концентрации этанола в среде 11,5 % об. культура продолжала размножаться и сбраживать остаточные углеводы, но увеличивалось содержание мертвых клеток до 30%. Концентрация спирта на 72 часа брожения составила 13,9 % об. против 9,2 % об. в контрольном варианте без введения дополнительных количеств этанола. Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что испытанная раса 985Т устойчива к концентрациям спирта до 14%об., о чем свидетельствует прирост спирта в бражке, адекватный введенному количеству. Аналогичные результаты были получены с дрожжами р. 987О.
В дальнейшем исследовали процесс сбраживания ржаного сусла с концентрацией сухих веществ 24% и 31% дрожжами рас 985 Т и 987 О. В качестве осахаривающих средств использовали ферментные препараты Зимаджунт в количестве 0,5 ед. и 0,7 ед. АС/г и Глкжозим - 9 ед. и 12 ед. ГлС/г крахмала, соответственно.
Таблица 1.
Влияние различных концентраций спирта на жизнедеятельность
дрожжей S.cerevisiae 985T-4
Добавка
этанола на
24 ч.
брожения, % об. Количество дрожжей, млн./мл
Характеристика брожения на 24
часа
роста на 48 часов роста РВ, г/ 100мл Спирт % об. При
спир. всего
мертвых,
%
48 часов
72 часа
48часов
72часа
-
3
5
7 110
98
105
110 81
74
74
68 -
13,6
29,5
41,0 0,27
0,66
1,81
2,9 -
0,5
0,85
3,05 6.,5
9,5
11.5
13.5 9,2
12,0
13,9
14,0 0
2,9
4,7
4,8
Известно, что обмен веществ у дрожжей находится в прямой зависимости от азотистого питания. При повышении концентрации зернового сусла увеличивается содержание потребляемых углеводов и возрастает потребность дрожжей в легкоассимилируемом аминном азоте. В связи с этим изучали влияние дополнительных источников азота при сбраживании сусла с концентрацией сухих веществ 31%. Для этого в осахаренное сусло вводили мочевину (0,1%), а также использовали протеолитическии комплекс ферментного препарата Амилопротооризин, гидролизующий белки сусла до аминокислот и коротких пептидов . Контролем служили дрожжи расы ХП. Полученные результаты приведены в табл.2.
Дрожжи рас 985Т и 987 О сбраживали сусло с концентрацией сухих веществ 24% с нормативными показателями на 72 часа брожения. С повышением осмоса (СВ 31%) дрожжи претерпевали некоторые изменения: клетки становились более зернистыми, стенки уплотнялись, замедлялось их развитие, увеличивалось количество мертвых клеток.
Особенно это отразилось на дрожжах р.ХП: на 24 ч роста концентрация дрожжевых клеток составила 45 млн/мл, почкующихся - 7% (для осмофильных дрожжей - 67-68 млн/мл, почкующихся - 10-12%). Внесение дополнительного азотистого питания увеличивало прирост биомассы дрожжей и способствовало их почкообразованию.
Полученные сравнительные данные по потреблению углеводов подтверждают, что отселекционированные расы дрожжей проявляют большую устойчивость к повышенному осмосу, чем р. ХП, что сказалось на результатах сбраживания высококонцентрированного ржаного сусла. Так, через 24 ч брожения количество остаточных углеводов в опытных вариантах составило 12,8-13,6 % РВ, в то время как в контрольном - 18Д % РВ; к 72 ч их концентрация снизилась до 1,1-1,2% РВ и 2,8% РВ, соответственно. Внесение дополнительного азотистого питания позитивно сказалось на интенсивности процесса брожения (табл.2). Применение осмофильных рас дрожжей позволило повысить концентрацию спирта до 15% и увеличить его выход на 72 ч брожения.
Многие авторы изучали влияние таких технологических факторов, как температура, концентрация сухих веществ зернового сусла и этанола на метаболизм широко используемой в промыпшенностй ХП расы и новых отселекционированных штаммов 985-Т и 987-О. Анализ процесса сбраживания сусла осуществляли с учетом изменения основных технологических показателей, содержания спирта и побочных метаболитов дрожжей, определяющих связь энергетического и конститутивного обмена дрожжевой клетки.
Реальным способом интенсификации биотехнологического процесса является использование термотолерантных рас для сбраживания зернового сусла при повышенных температурах. При этом необходимо контролировать процессы накопления не только этанола, но и других продуктов, синтезируемых при брожении, чтобы не только сократить сроки брожения, но и получить высококачественный спирт . Известно, что мезафильные дрожжи при повышенных температурах теряют свою физиологическую активность, что ведет к ослаблению клеток и изменению их метаболизма .
Кроме того, снижается конкурентоспособность дрожжевой культуры по отношению к посторонней микрофлоре, возрастает опасность инфицирования, что приводит к потерям сырья и отрицательно сказывается на качестве спирта в связи с образованием посторонних метаболитов. Поэтому изучали влияние температуры на метаболизм дрожжей рас ХП, 985-Т и 987-О. Сбраживание ржаного сусла осуществляли при обычной температуре 29-30°С и повышенной - 35-360С.
Все расы дрожжей обеспечивали при 30°С нормальное протекание процесса брожения, и к 66 часам выход спирта составил 66,5-66,7 см3/100г крахмала (табл.3). Однако исследуемые расы различались по уровню накопления основных примесей (ацетальдегид, метилацетат, этилацетат, пропанол, изобутанол, бутанол, изоамилол). Суммарное количество побочных метаболитов, синтезируемых расами 985-Т и 987-О, в 1,25 раза было ниже аналогичного показателя у расы ХП (табл. 4).
Повышение температуры брожения до 36°С существенно отразилось на физиологической активности дрожжей и более резко выявило их различие. Особенно отрицательно это сказалось на расе ХП: снизилась способность дрожжей к размножению, их упитанность, вырос коэффициент гибели клеток и к 42 ч роста составил 12% против 1,5 % у расы 985-Т. В то время, как термотолерантная раса 985-Т более активно размножалась, интенсивно ассимилировала углеводы, и уже к 42 ч брожения процесс был практически прекращен: выход спирта составил 66,6 см3/100 г крахмала, к 66 ч - 66,9 см3/100 г. При использовании расы 987-О и ХП выход целевого продукта за этот же период был на уровне 65,2-65,5 см3/100 г крахмала (к 66 ч - 65,9 см3/100г), что на 2% ниже, чему расы 985-Т (табл.3).
Исследуемые расы дрожжей отличались друг от друга и по количеству синтезируемых побочных метаболитов. При повышенной температуре меньше всего примесей образовывала термотолерантная раса 985-Т: суммарное количество основных летучих веществ было почти в 2 раза ниже, чем у расы ХП (табл.3). Концентрация побочных метаболитов, синтезируемых дрожжами 987-О, незначительно превышала аналогичные показатели расы 985-Т. Отмечена также тенденция повышения уровня накопления основных вторичных продуктов при увеличении продолжительности брожения, особенно для расы ХП.
Таким образом, применение термотолерантной расы 985-Т позволяет не только интенсифицировать процесс брожения и повысить технологические показатели, но и улучшить качество целевого продукта. Повышенные температуры отрицательно сказываются на расе ХП, что ведет к недоброду и ухудшению технологических показателей брожения. При этом выход спирта снизился на 1%, а суммарная концентрация основных примесей повысилась в 1,35 раза по сравнению с процессом, проводимым при 30°С.
Как видно из таблицы 4, дрожжи 985-Т более рационально ассимилировали углеводы среды, направлено синтезируя этанол с одновременным снижением уровня образования вторичных продуктов брожения. Концентрация практически всех идентифицированных метаболитов была ниже, чем у расы ХП. Особенно это сказалось на синтезе высших спиртов, эфиров и альдегидов.
Различие исследуемых рас резко проявилось при повышении температуры и осмоса. Более негативное воздействие экстремальные условия оказали на ХП расу, что привело к увеличению образования практически всех побочных метаболитов, особенно адетальдегида, метилацетата, этилацетата, пропанола. У расы 985-Т эта тенденция менее выражена: уровень накопления побочных продуктов обмена при повышенных температуре и осмосе был практически в 1,5 раза ниже, чем у р. ХП.
В литературе по данной проблеме указывается, что при совершенствовании технологических процессов следует осуществлять контроль производства не только по накоплению этилового спирта и сбраживанию углеводов сырья, но и по показателям конститутивного обмена, т.е. по концентрации побочных соединений, образующихся в результате роста и размножения дрожжей. Такой подход обеспечит не только полноту сбраживания сусла, но и хорошие органолептические свойства готового продукта. Поэтому, выбор и использование расы дрожжей, наиболее подходящей к конкретным условиям предприятия, может повысить рентабельность производства и улучшить качество спирта.
Таким образом, расы 985-Т и 987-О с осмофильными и термотолерантными свойствами способствуют повышению эффективности спиртового производства не только в результате интенсификации технологического процесса и возможности сбраживания высококонцентрированного сусла, но и улучшения качества конечного продукта.
Проведены производственные испытания отселекщюнированных рас дрожжей на спиртовых заводах, где ранее применялись XII, К-81 и Y-717 расы.
Новая раса дрожжей Saccharomyces cereviske 985-Т проявила высокую кисло- и термоустойчивостъ, а также конкурентоспособность к посторонней микрофлоре. Подгоерждена эффективность использования этой расы для интенсификации спиртового брожения. Длительность сбраживания ржаного сусла сокращалась на 15-20 часов (табл. 5).
При совершенствовании технологических процессов следует осуществлять контроль производства не только по накоплению этилового спирта и интенсивности сбраживания углеводов сырья, но и по показателям конститутивного обмена, т.е. по концентрации побочных соединений, образующихся в результате роста и размножения дрожжей. Такой подход обеспечит не только полноту сбраживания сусла, но и хорошие органолептические свойства готового продукта. Поэтому, выбор и использование расы дрожжей, наиболее подходящей к конкретным условиям предприятия, может повысить рентабельность производства и улучшить качество спирта.
Использование термотолерангаых и осмофильных рас 985-Т и 987-О для сбраживания зернового сусла при повышенных температурах и осмосе позволяет не только сократить сроки брожения, но и получить высококачественный спирт.
Различие исследуемых рас резко проявляется при повышении температуры и осмоса. Более негативное воздействие экстремальные условия оказывают на ХП расу, что приводит к увеличению образования практически всех побочных метаболитов, особенно ацетальдегида, метилацетата, этилацетата, пропанола. У расы 985-Т эта тенденция менее выражена: уровень накопления побочных продуктов обмена при повышенных температуре и осмосе был практически в 1,5-2 раза ниже, чем у р. ХП.
Дрожжи расы ХП, М, К-81 и др. при повышенных температурах и осмосе теряют свою физиологическую активность, что ведет к ослаблению клеток, изменению их метаболизма, снижению конкурентоспособности дрожжевых клеток по отношению к посторонней микрофлоре. Это приводит к потерям сырья и отрицательно сказывается на качестве спирта в связи с образованием посторонних метаболитов. Суммарное количество побочных метаболитов, синтезируемых расами 985-Т и 987-О, почти в 2 раза ниже аналогичного показателя у расы ХП при повышении температуры брожения до 35-36°С. Кроме того, использование дрожжей расы 985-Т и 987-О при сбраживании высококонцентрированного сусла также позитивно сказывается на качестве целевого продукта: суммарная концентрация основных примесей снижается практически в 1,5 раза по сравнению с ХП расой.
В настоящее время подтверждена технологическая устойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae 985 Т в промышленных условиях в течение года с сохранением приобретенных свойств. ГЛАВА 2. ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ 2.1. Технология применения дрожжейСуществует апробированная Технологическая схема и Технологическая инструкция по применению дрожжей Saccharorayces cerevisiae 985 Т в спиртовом производстве (схема 1).
В инструкцию включены разделы по морфологической и кулътуральной характеристике отселекционированной расы, описаны условия хранения чистой культуры дрожжей в лаборатории, приведены разделы по разведению чистой культуры в производственных условиях, приготовлению засевных и производственных дрожжей и режимам брожения.
Анализируя результаты производственных испытаний, опыт работы заводов, данные экспериментальных исследований можно сделать следующие выводы:
- для повышения эффективности спиртового брожения рекомендуется использование новых термотолерантных и осмофильных рас дрожжей Saccharomyces cerevisiae 985-Т и 987-О;
- применение термотолерантных и осмофильных рас дрожжей при нормативных дозировках осахаривающих средств позволяет сократить процесс брожения до 50-60 часов;
- повысить температуру сбраживания сусла до 35-56 °С и сократить длительность брожения до 48 ч;
- увеличить концентрацию сбраживаемого сусла и повысить концентрацию спирта в бражке;
- для устойчивой работы завода с активными расами спиртовых дрожжей рекомендуется один раз в год проводить разведение чистой культуры. Своевременное обновление промышленных рас дрожжей позволит поддерживать их в активном состоянии и сохранять термотолерантные и осмофилъные свойства в течение длительного пассажирования в производственных условиях, что бу-
дет способствовать повышению производительности бродильного отделения.
Cхема 1.
Технологическая схема приготовления производственных дрожжей
Промышленную проверку разработанной технологии проводили на Мичуринском экспериментальном заводе, а также на ряде заводов отрасли (Костромском, Анненковском, Куйбышевском, Донском и др. спиртовых заводов).
Производственные испытания проводились по двум направлениям:
1. Интенсификация спиртового брожения с использованием комплексного ферментного препарата Амилопротооризина КФПА - источника комплекса протеолитических ферментов, экзо- и эндо--глюканаз, -амилазы, ксиланазы и ферментов целлюлолитического действия.
2. Интенсификация спиртового брожения с использованием новой отселекционированной расы термотолерантных и осмофильных дрожжей S. cerevisiae 985-Т.
На первом этапе проведены производственные испытания по наработке комплексного ФП Амилопротооризин КФПА в условиях ферментного цеха МЭЗ. Культивирование продуцента Aspergillus oryzae sp. проводили в промышленных ферментаторах объемом 32 м3. Длительность ферментации составила, в среднем, 46-50 часов. Средняя ферментативная активность в культуральной жидкости составила по -амилазе - 9-10 ед АС/мл, по протеазам 11-12 едПС/мл, по глюканазам - 7 ед/мл, ксиланазе - 3 ед/мл и целлюлозе - 5 ед/мл.
Полученная глубинная культура в количестве 35 т была передана в спиртовый цех для гидролиза белковых веществ и некрахмальных полисахаридов зернового сусла. В цехе на период испытаний перерабатывали зерносмесь пшеницы, ржи и ячменя в соотношении 68%, 7% и 25% соответственно. Амилопротооризин КФПА задавали в производство на стадии осахаривания в вакуумосахариватель совместно с глубинной культурой A. awamori - источником глюкоамилазы. Концентрацию сусла поддерживали на уровне 17-18%. Полученное с амилопротооризином сусло характеризовалось отличной степенью осахаривания и подавалось на поток, а также в дрожжанки и возбраживатели.
Отмечена интенсификация процесса дрожжегенерации при использовании КФПА амилопротооризин. В результате воздействия комплексного ферментного препарата Амилопротооризин на растительные белки зернового сусла среда обогащалась легкоусвояемыми для дрожжей аминокислотами, что сказалось на повышении бродильной активности дрожжей. Дрожжевые клетки отличались от контрольных повышенной упитанностью, высоким содержанием почкующихся клеток, отсутствием мертвых. На 11 часов роста опытные дрожжанки были готовы, отброд составил 5-6% СВ, в то время как в контрольных дрожжанках этот показатель составил 9-11% СВ.
Интенсифицировалось накопление биомассы дрожжей: концентрация клеток в опытных дрожжанках составила 127-140 млн/мл, в контрольных - 103-115 млн/мл на этот же период. Перед засевом концентрация дрожжевых клеток в опытных дрожжанках 157-185 млн/мл.
Аналогичные закономерности интенсификации роста и размножения дрожжей, а также повышения их качества наблюдалось и в возбраживателях. На 11 часов роста дрожжей в возбраживателях отброды снизились с 17,5% до 4-5% СВ. Концентрация клеток составила 148-163 млн/мл. В контрольных возбраживателях на этот же период концентрация клеток составила 72-94 млн/мл, отброд - 7,5% СВ. К 16 часам показатели в контрольных возбраживателях составили 5-5,5% СВ, а концентрация клеток - 112-140 млн/мл. Характеристика процессов дрожжегенерации представлена в таблице 6. Таким образом, как следует из полученных результатов, отмечена интенсификация процесса дрожжегенерации на 30-40%.
Сказалась эффективность использования КФПА для осахаривания и протеолиза крахмалсодержащего сырья и на технохимических показателях производственного потока. Отмечено, что средняя концентрация дрожжевых клеток в 1-ом и во 2-ом чанах опытного потока поддерживалась на уровне 70-84 млн/мл (табл.7). В контрольном потоке, где не использовали Амилопротооризин эти показатели составили 38-64 млн/мл. Такое стабильное поддержание концентрации дрожжевых клеток в головных чанах указывает на возможность продления залива потока до 4-х суток.
При использовании КФПА повышалась и скорость сбраживания сусла. Так, в первых четырех чанах средняя концентрация растворимых сухих веществ бродящей массы снизилась практически в 2 раза по сравнению с контрольным потоком. Средние показатели отбродов уже с 5-го чана составляли 0,6% СВ (в контроле - 3,4%), при этом концентрация углеводов в опытном потоке снижалась до 0,5 г/100 мл. Аналогичные показатели в контрольном потоке были достигнуты только к концу брожения.
Таблица 6.
Характеристика развития дрожжей в производственных дрожжанках
№ дрож-
жанки и дата
кладки Продол-житель-
ность роста, ч. Конц-ция СВ,
% Кислот-
ность Дрожжи,
млн/мл Характеристика
дрожжевых
клеток
Контрольные дрожжанки
№ 1
31,01 0 15,0 0,75
11 9,0 0,9 115 Упитанность слабая
15 5,0 0,9 141 мертвых клеток - 8%
№ 2
31,01 0 15,0 0,65
11 11,2 0,85 103 Упитанность слабая
15 6,0 0,85 122 мертвых клеток - 5%
Опытные дрожжанки
№ 1
03,02 0 15,2 0,85
11 6,0 0,9 140 Упитанность хорошая,
5,0 1,0 185 мертвых клеток нет
№ 2
03,02 0 15,0 0,8
11 7,0 0,85 127 Упитанность средняя,
4,5 0,9 157 мертвых клеток нет
Контрольные возбраживатели
№1/№2 0 18/17,5 0,7/0,7
12 7,5/7,5 0,7/0,7 72/94 Упитанность средняя,
16 5,0/5,5 0,8/0,9 112/140 мертвых клеток нет
Опытные возбраживатели
№1/№2 0 17,5/17,0 0,7/0,7 Упитанность средняя,
11 5,0/4,0 0,9/0,8 163/148 мертвых клеток нет
Таблица 7.
Средние показатели отброда в производственных чанах
№ чана
Отброд, % СВ
Контрольный поток Опытный поток I
7,4
5,0 П
6,6 4,0 III
4,0
2,0 IV
3,4
0,9 V
2,0
0,6
VI
1,3
0,4 VII
0,6
0,35 VIII
0,45
0,2
2.2. Описание технологического процесса приготовления
производственных дрожжейВ спиртовом производстве засевные дрожжи ведут по методу естественно-чистой культуры, что предусматривает создание условий, необходимых для размножения дрожжей, но угнетающих развитие посторонней микрофлоры. Такие условия достигают при поддержании значения рН дрожжевого сусла от 3,4 до 4,2. Подкисление дрожжевого сусла производят серной кислотой, реже молочной кислотой, образующейся за счет предварительного размножения на дрожжевом сусле молочнокислых бактерий.
При периодическом процессе брожения в качестве засевных дрожжей используют зрелые дрожжи из дрожжанки (дрожжегенератора) перед спуском ее содержимого в бродильный чан. 2.2.1. Разведение дрожжей из чистой культуры
Разведение дрожжей из чистой культуры применяют в начале производственного сезона, после длительного простоя или при инфицировании производственных дрожжей.
При нормальной работе завода чистую культуру разводят из пробирки 1 раз в 4-6 месяцев. Однако допускают увеличение сроков периодичности разведения культуры до 8-12 месяцев.
Чистую культуру дрожжей S. cerevisiae 985-Т получают из ВНИИПБТ по заявкам спиртовых заводов.
Все операции по разведению чистой культуры дрожжей должны проводиться в отдельном помещении (боксе), при закрытых дверях и окнах с соблюдением микробиологической чистоты.
Разведение чистой культуры дрожжей S. cerevisiae 985-Т в производственных условиях спиртзаводов проводили путем последовательных пересевов с возрастающим объемом среды с колбы до производственной дрожжанки (дрожжегенератора) в соответствии с «Инструкцией по технохимическому и микробиологическому контролю спиртового производства», Москва, 1986 г. и «Технологической инструкцией по ведению чистой культуры термотолерантных дрожжей Saccharomyces cerevisiae 985-Т в спиртовом производстве» (ТИ 10-12606-2000), а также разработанной в рамках настоящего Договора «Технологической инструкцией по применению термотолерантной и осмофильной расы дрожжей S. cerevisiae 985-Т в спиртовом производстве». Состав питательных сред на всех стадиях разведения чистой кулыуры сохраняли согласно действующему на заводе регламенту.
При разведении чистой культуры на работающем заводе на первых стадиях разведения (колба-бутыль) использовали дрожжевое сусло, отбираемое после дополнительного осахаривания, а на стадии маточник-дрожжанка - подкисленное дрожжевое сусло с введением дополнительного питания. 2.2.2. Приготовление производственных засевных дрожжей
Для разведения дрожжей в начале производственного цикла использовали сусло, приготовленное из ржаной муки и воды. На 1 кг муки берут 5 л воды. Муку смешивали с водой при температуре 35-40 °С и раствором бактериальной -амилазы из расчета 3-4 ед АС /г крахмала сырья. Смесь нагревали при постоянном перемешивании и выдерживали при этой температуре в течение 1 часа, затем охлаждали до температуры 56-58°С, после чего вносили растворы глюкоамилазы из расчета 12-15 ед ГлС/г крахмала сырья и протеазы Амилопротооризина КФПА из расчета 0,8 ед ПС/г крахмала. При этой температуре сусло осахаривали 2-3 часа. Конец осахаривания определяли по йодной пробе, которая должна иметь желтую окраску. Осахаренное сусло фильтровали через плотную ткань. Концентрация сусла была в пределах 10-12% сухих веществ. Готовое сусло разливали по 0,5 л в литровые колбы и стерилизовали в автоклаве при 0,05 МПа в течение 30 мин. Через 18 ч брожения засевные дрожжи стадии были готовы.
Для приготовления засевных дрожжей П-ой стадии через 18-20 часов бродящее сусло переливали в бутыль с 5 л стерильного нефильтрованного сусла, подкисленного до значения рН от 3,8 до 4,6.
Сусло для производственных дрожжей готовится аналогично приготовлению сусла для маточных дрожжей, описание которого приведено ниже.
Температура складки производственных засевных дрожжей при засеве маточной кулыуры S. cerevisiae 985-Т составила 20-24°С. Температура брожения на стадии дрожжегенерации - 30-32°С, количество засевных дрожжей на этой стадии соответствовало 8-10% от рабочего объема дрожжанки (дрожжегенератора).
Содержание дрожжевых клеток в зрелых дрожжах было, в среднем, 80 130 млн/мл, мертвых клеток - не более 1%, упитанность (по окраске с йодом) была удовлетворительной. Значение рН готовых производственных дрожжей поддерживали на уровне от 3,4 до 4,2, что является одним из условии, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность дрожжей. В случае использования недостаточно качественного сырья для повышения чистоты брожения рН зрелых дрожжей понижали до величины 3,2-3,4 путем внесения дополнительного количества серной кислоты.
Полученные готовые производственные дрожжи направляют в бродильные чаны основного производства из расчета 8-10% от рабочего объема чана для засева осахаренного сусла. Часть дрожжей оставляют в дрожжегенераторе в виде матки для засева свежей партии сусла.
Длительность процесса дрожжегенерации новых термотолерантных дрожжей S. cerevisiae 985-T на стадии приготовления производственных засевных дрожжей сократилась, в среднем, на 30-40% по сравнению с используемыми ранее на этих заводах дрожжей S. cerevisiae рас ХП, К-81 и Y-717. 2.2.3. Получение маточных дрожжей
При приготовлении сусла для получения маточных дрожжей использовали отъем осахаренного сусла из основного производства.
Сусло готовили из ржаного сырья с концентрацией сухих веществ от 16 до 18% (по сахарометру или рефрактометру) по режимам разваривания и осахаривания, принятым на заводе.
Для повышения степени осахаривания в отъем зернового сусла, взятого с основного производства, вносили дополнительное количество ферментного препарата - источника глюкоамилазы из расчета от 3,0 до 6,0 ед/г крахмала. На этой же стадии для гидролиза белковых веществ в отдельных: случаях, при наличии на заводе Амилопротооризина, задавали ФП протеолитического действия (Амилопротооризин КФПА), что позволяет интенсифицировать скорость размножения дрожжей за счет обогащения сусла лекоусвояемым азотистым питанием. Дозировка ФП, содержащего активные пептидазы, составляла 0,3 ед ПС/г крахмала. Количество дрожжевых клеток ври этом увеличивалось до 120-150 млн/мл, количество почкующихся клеток - до 15-18%.
Доосахаривание проводили при температуре 58-60°С в течение 1,5-2 часов. При проведении доосахаривания дополнительные количества ФП вносили непосредственно в дрожжанку перед заполнением ее суслом.
В качестве азотистого питания для дрожжей, где не использовали КФПА Амилопротооризин, задавали после осахаривания карбамид из расчета 600-700 г/м3 или диаммоний фосфат - 250-300 г/м3 сусла. Ферментные препараты и минеральные соли задавали в виде чистого водного раствора, приготовленного в соотношении 1:10. Дозировка минеральных солей может корректироваться в зависимости от вида перерабатываемого сырья и физиологического состояния дрожжей.
Приготовленное таким образом сусло пастеризовали при температуре 85 °С в течение 30 минут, затем подкисляли серной кислотой до значения рН от 3,6 до 4,2, тщательно перемешивая.
Полученное дрожжевое сусло использовали для засева маточных дрожжей. Объем засевных дрожжей составил 8-10% к объему сусла в маточнике. Температура складки 20-24°С. Температура дрожжегенерании -30-32°С. Длительность дрожжегенерации составила 10-12 ч (против 18-24 ч в контрольных вариантах). Величина видимой плотности (отброда) зрелых маточных дрожжей составила к этому времени 1/3 от исходной концентрации сусла.
Количество клеток в 1 мл зрелых (засевных) дрожжей составила при использовании КФПА - 170 млн/мл, без протеаз (с минеральным питанием) -80-120 млн/мл. Зрелые дрожжи были хорошей упитанности, обладали высокой бродильной активностью, количество мертвых клеток не превышало 1%. Маточные дрожжи передавали на стадию приготовления производственных дрожжей. Длительность дрожжегенерации новых термотолерантных дрожжей S. cerevisiae 985-T сократилась в 1,5-2 раза по сравнению с используемыми ранее на этих заводах дрожжей S. cerevisiae рас ХП, К-81 и Y-717. 2.2.4. Сбраживанне производственного сусла
Процесс сбраживания зернового сусла осуществляли в бродильных чанах периодическим способом, при котором в каждый бродильный чан подавали одновременно с суслом производственные дрожжи.
Использование термотолерантных и осмофильных дрожжей расы 985-Т позволило интенсифицировать процесс брожения. Для этого повышали температуру складки до 24-26°С, температуру головного брожения до 33-36°С (но не выше 37°С). После 36-42 часов при дображивании температуру снижали до 30-32°С, чтобы снизить риск инфицирования бражки. Продолжительность сбраживания составила, в среднем, 50-60 часов против 72-78 ч брожения, имеющих место на заводах до введения новой расы дрожжей.
Таким образом, внедрение новой расы термотолераных дрожжей S.
cerevisiae 985-Т позволило сократить длительность процессов дрожжегенерации и брожения на 30-40% по сравнению с используемыми ранее на этих заводах дрожжей S. cerevisiae рас ХП, К-81, 1985 и Y-717.
Для сокращения длительности брожения до 42-48 часов необходимо на стадии осахаривания:
введение Амилопротооризина (КФПА) в дозировке 0,3 ед ПС/г крахмала;
- увеличение длительности осахаривания до 2-х часов;
- увеличение расхода глюкоамилазы до 7,0 ед ГлС/г крахмала.
При переработке трудно сбрасываемого сырья, такого как ячмень и рожь, с целью интенсификации спиртового брожения рекомендуется использование ферментных препаратов (Амилопротооризина, Целловиридина, Шеарзима, Зимафилта, и др.)
ЗАКЛЮЧЕНИЕНовые направления развития технологии производства спирта ставят такие задачи, как повышение концентрации перерабатываемого сусла, проведение брожения при повышенных температурах и повышенной крепости в бражке, обеспечение дальнейшего сокращения себестоимости спирта за счет экономии сырья, топлива и электроэнергии. В таких условиях нужны расы дрожжей, обладающие осмофильностью, термостабильностью и высокой бродильной активностью. Поэтому селекционные работы по скринингу активных рас дрожжей являются также перспективным направлением совершенствования технологии производства спирта. В настоящее время получены новые высокопродуктивные расы дрожжей, обладающие осмофильностью и термотолерантностью. Эти расы способны сбраживать сусло с концентрацией сухих веществ более 20%, они устойчивы к повышенным температурам брожения и повышенным концентрациям спирта. Внедрение термотолерантных и осмофильных рас дрожжей позволит ускорить процесс брожения, увеличить выход спирта, повысить его качество и снизить потери сырья.
Работа над темой показала, что в результате производственных испытаний разработанной биотехнологии интенсивного сбраживания зернового сусла с применением новых рас дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами в производственных условия спиртовых заводов осуществляется скрининг новой расы термотолерантных и осмофильных дрожжей S. cerevisiae 985-Т, устойчивой к повышенным температурам, осмосу и концентрациям спирта. Установлена высокая конкурентоспособность отселекционированной расы дрожжей к посторонней микрофлоре. Внедрение этой расы позволяет сократить длительность дрожжегенерации и спиртового брожения на 30-40%, а также стабилизировать процесс брожения (особенно в летний период времени), сократить потери сырья, повысить качество целевого продукта - этанола.
Термотолерантная раса дрожжей S. cerevisiae 985-Т внедрена на ряде заводов спиртовой отрасли. Существует и технологическая инструкция по применению термотолерантной и осмофильной расы дрожжей S. cerevisiae 985-Т в спиртовом производстве, которая апробирована в производственных условиях.
Внедрение результатов научно-исследовательских работ позволит повысить эффективность спиртового производства, ускорить процесс биоконверсии зернового сырья, уменьшить расход электроэнергии, увеличить выход спирта, повысить качество конечного продукта, что обеспечит снижение себестоимости спирта, повышение его конкурентоспособности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Усачев А.М. Состояние и подготовка законопректов алкогольной отрасли //Производство спирта и ликероводочных изделии. 2002. - № 1. -С. 4-5.
2. Поляков В.А., Римарева Л.В., Ксандопуло Г.Б. Перспективные биотехнологнческие процессы для спиртовой промышленности //Производство спирта и ликероводочных изделий. 2002. - № 1. -С. 6-8.
3. Иванова Е.Г., Киселева Л.В., Ленец КГ., Петрова Г.А. Влияние гемицеллюлаз на гидролиз некрахмальных полисахаридов //Пиво и напитки. - 2002. - № 2, с. 19-22.
4. Лихтенберг Л. А. Влияние технологаческих приемов на качество спирта //Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2001. - № 2, с.28-29.
5. Рухлядева А.П. Техно-химический контроль спиртового производства. - М., Пищевая пр-сть. - 1974. - 355 с.
6. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности.
7. ГОСТ Р 51762- 2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод содержания летучих кислот и фурфурола.
8. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И. Практическое руководство по биохимии растений. М.: Сов. наука, 1951. С. 130-131.
9. Андреев Н.Р., Ладур Т.А., Филлипова Н.И. Переработка ржи на крахмал. - М.: АгроНИИТЭИПП. -1995. - Вып.1.
10. Фертман ГЛ, Шойхет М.Й. Биохимические основы бродильных производств. М.: Пищепромиздат. - 1970. - 240 с.
11. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. М. Пищевая промышленность. -1980. - 240 с.
12. Римарева Л.В. Биотехнология комплексных препаратов кислых протеаз и их роль в интенсификации технологических процессов в перерабатывающих отраслях АПК. Автореф. Докт. Диссерт. М. - 1997. - 51с.
13. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И., Кадиева А.Т., Шелехова Т.М., Веселовская О.В. Рациональный выбор расы спиртовых дрожжей //Производство спирта и ликероводочных изделии. -2001.-№2, с. 19-21.
14. Римарева Л.В., Оверченко М.Б. Состояние и перспективы развития биотехнологических процессов в пищевой промышленности». - М.: Пищепромиздат. 2001. - С. 93.
15. Грачева И.М. Прикладная биохимия и микробиология 1983. - Т.19. - № 1. - С.ЗЗ.
16. Plant A.R., Clemens R.M., Daiel R.M., Morgan H.W. Purification and preliminary characterization of an extracellular pullulanase from Thermoanaerobium //Appl. Microbiol. And Biotechnol. 1987. - 26., N5, 427-433.
17. Spreinat A., Antranikian G. Purification and synergistic action of pullulanases and maltohexaose forming -amylase //Starke. -1992. - 44. N8. C.305-312. |
